BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Perkembangan bioteknologi modern di awal tahun 1970-an telah membuka cakrawala baru dunia ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai disiplin ilmu bergerak bersama dalam proses pengembangan teknik-teknik yang digunakan dalam penelitian biologi molekuler. Kajian aktivitas terpadu antar ilmu-ilmu biologi, biokimia, genetika, mikrobiologi, teknik kimia, komputasi, dan biofisika dengan menggunakan pendekatan biologi molekuler untuk menghasilkan suatu barang dan jasa yang terkait dengan perkembangan IPTEK.
Bioteknologi berasal dari kata latin yaitu bio (hidup), teknos (teknologi = penerapan) dan logos (ilmu). Bioteknologi adalah cabang biologi yang mempelajari pemanfaatan prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, proses biologis untuk meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan manusia.
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika guanin berikatan dengan sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida.
Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.
1.2. Tujuan Praktikum
1. Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana
2. Melihat presipitasi DNA
3. Mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate
4. Mengetahui cara membuat pohon filogenetik yang menunjukan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme yang lain
1.3. Manfaat Praktikum
1. Praktikan dapat melakukan cara mengekstraksi dari DNA
2. Praktikan mempunyai kemampuan untuk mengidentifikasi dari kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate
3. Praktikan mempunyai kemampuan untuk teknik – teknik membuat pohon filogenik yang menunjukkan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengertian DNA dan RNA
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat(DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat(RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan posisi 5′ pada mononukleotida lainnya(Harpet, 1980).
DNA merupakan suatu polimer besar dengan property karakteristik fisik yang unik. Eksploitasi ukuran dan struktur kimia DNA dapat dilakukan dengan isolasi dan purifikasi. Sebagian besar teknik isolasi DNA memerlukan lisis sel, yang dilanjutkan dengan ekstraksi protein dengan menggunakan larutan organic berbasis fenol dan presipitasi DNA dalam ethanol. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometri dengan menghitung ratio hasil pengamatan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm = 1,8. Keutuhan relative DNA dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Apabila purifikasi diperlukan, metode kromatografi bisa digunakan atau dengan penambahan enzim RNase.
DNA merupakan suatu polimer besar dengan property karakteristik fisik yang unik. Eksploitasi ukuran dan struktur kimia DNA dapat dilakukan dengan isolasi dan purifikasi. Sebagian besar teknik isolasi DNA memerlukan lisis sel, yang dilanjutkan dengan ekstraksi protein dengan menggunakan larutan organic berbasis fenol dan presipitasi DNA dalam ethanol. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometri dengan menghitung ratio hasil pengamatan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm = 1,8. Keutuhan relative DNA dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Apabila purifikasi diperlukan, metode kromatografi bisa digunakan atau dengan penambahan enzim RNase.
DNA ditemukan pada Tahun 1869 Oleh Johann Friedrich Miescher, seorang Ahli Biokimia pertama kali Miescher mengekstrak sel-sel menggunakan darah putih dan memperoleh campuran antara DNA dan protein-protein kromosom. Yang berikutnya ekstrak asam nukleat adalah murni diperoleh menggunakan sperma ikan salmon. Uji kimiawi DNA menunjukkan bahwa DNA tersebut ditemukan Miescher Yang bersifat asam banyak mengandung dan fosfor.
Tiga Tahun sebelum Miescher menemukan DNA, Gregor Mendel telah mempublikasikan Perkawinan Hasil percobaan kacang ercis Dan menghipotesiskan bahwa pewarisan genetik dikendalikan faktor unit Oleh, Oleh materi butir Yang Ahli genetika disebut gen sekarang.
Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida(Dage, 1992). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat(DNA) dan asam ribonukleat(RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA(mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya(fessenden, 1990). Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan dengan DNA, antara lain yaitu(Poedjiati, 1994):
Tiga Tahun sebelum Miescher menemukan DNA, Gregor Mendel telah mempublikasikan Perkawinan Hasil percobaan kacang ercis Dan menghipotesiskan bahwa pewarisan genetik dikendalikan faktor unit Oleh, Oleh materi butir Yang Ahli genetika disebut gen sekarang.
Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida(Dage, 1992). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat(DNA) dan asam ribonukleat(RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA(mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya(fessenden, 1990). Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan dengan DNA, antara lain yaitu(Poedjiati, 1994):
1. Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah dioksiribosa
2. .Bentuk molekul DNA adalah heliks ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai tunggal yang terlipat, sehingga menyerupai rantai ganda
3. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi tidak mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil.
4. Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin, demikian pula jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil.Selain itu perbedaan RNA dengan DNA yang lain adalah dalam hal(Suryo, 1992):
a. Ukuran dan bentuk
Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA berbentuk double helix, sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. Meskipun demikian pada beberapa virus tanaman, RNA merupakan pita double namun tidak terpilih sebagai spiral.
Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA berbentuk double helix, sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. Meskipun demikian pada beberapa virus tanaman, RNA merupakan pita double namun tidak terpilih sebagai spiral.
b. Susunan kimia
Molekul RNA juga merupakan polimer nukleotida, perbedaannya dengan DNA yaitu:
Molekul RNA juga merupakan polimer nukleotida, perbedaannya dengan DNA yaitu:
1. Gula yang menyusunnya bukan dioksiribosa, melainkan ribosa.
2. Basa pirimidin yang menyusunnya bukan timin seperti DNA, tetapi urasil.
c. Lokasi
DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung dari macamnya, yaitu:
DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung dari macamnya, yaitu:
1. RNA d(RNA duta), terdapat dalam nukleus, RNA d dicetak oleh salah satu pita DNA yang berlangsung didalam nukleus.
2. RNA p(RNA pemindah) atau RNA t(RNA transfer), terdapat di sitoplasma
3. RNA r(RNA ribosom), terdapat didalam ribosom.
d. Fungsinya
DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan fungsi RNA tergantung dari macamnya, yaitu:
DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan fungsi RNA tergantung dari macamnya, yaitu:
1. RNA d, menerima informasi genetik dari DNA, prosesnya dinamakan transkripsi, berlangsung didalam inti sel.
2. RNA t, mengikat asam amino yang ada di sitoplasma
3. .RNA t, mensintesa protein dengan menggunakan bahan asam amino, proses ini berlangsung di ribosom dan hasil akhir berupa polipeptida. Ada beberapa cara untuk menentukan DNA dan RNA, yaitu(Frutan and Sofia, 1968):
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika guanin berikatan dengan sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.
Genom adalah set lengkap materi genetic (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globules lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah),
leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, dimana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:
(1)Isolasi sel
(2)Lisis dindingdan membran sel
(3)Ekstraksi dalamlarutan
(4)Purifikasi dan
(5)Presipitasi.
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA.
2.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.
2.2.1. Teknik Dasar Amplifikasi PCR
Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai temperatur yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986, akan tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable, dan harus ditambahkan disetiap siklusnya. Kelemahan lain temperature 37°C yang digunakan bias dan menyebabkan non-specific priming, sehingga menghasilkan produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA polymerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Ensim ini tahan sampai temperature mendidih 100°C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 92-95°C.
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi:
– denaturation (95°C), 30 detik
– annealing (55–60°C), 30 detik
– extension (72°C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi.
Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif, seperti yang terlihat pada gambar1B
Gambar1. Siklus dasar PCR. A. Sistem tiga temperatur yang berbeda. B. Kenaikan hasil amplifikasi menunjukkan pertumbuhan sigmoid.
2.2.2. Denaturasi untai ganda DNA
Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR. Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA. Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC, suhu 94ºC merupakan pilihan standar.
Gambar2. Reaksi skematis proses amplifikasi.
Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan GC yang tinggi dari DNA template, tetapi half-life dari Taq DNA Polymerase menekan secara tajam pada temperatur sekitar 95ºC.
2.2.3. Primer Annealing
Primer Annealing, pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Cara termudah menghitung untuk mendapatkan melting-temperatur yang tepat menggunakan rumus Tm = {(G+C)x4} +{ (A+T)x2}. Rumus standar dapat dilihat di subbab primer pada komponen PCR. Sedang temperatur annealing biasanya 5ºC ddibawah Tm primer yang sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA template
Gambar3. Optimalisasi Temperatur Annealing. Primer dikalkulasi untuk menentukan annealing temperature (misal 54°C). Temperature must be confirmed practically dengan menggunakan gradient cycler. Step temperature berjarak 2°C per gradient analysis.
Amplifikasi akan lebih effisien bila temperatur annealing tidak kurang dari 37ºC agar tidak terjadi mispriming. Oleh karena itu, pada temperatur sekitar 55ºC akan dihasilkan amplifikasi produk yang mempunyai spesifitas yang tinggi. Penyusunan primer dapat dilihat disubbab primer dari komponen primer. Primer ini akan menempel pada urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan primer itu sendiri, dan menempel pada posisi ujung-5’ dari untai DNA target yang telah terurai pada proses sebelumnya.
2.2.4. DNA Polymerase extension
Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurand dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya (lihat contoh pada tabel 2). Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72°C.
Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase yang thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler.
2.2.5. Template DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.
Kemurnian DNA target sangat penting, karena ketidakmurnian suspensi DNA dapat mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja ensim DNA polymerase. Meskipun demikian, pada kondisi tertentu amplifikasi PCR masih dapat bekerja dalam suspensi kasar, seperti koloni bakteri. Bakteri tidak perlu diekstraksi dan secara langsung dicampurkan pada PCR mix solution sebagai template.
Pemilihan target yang akan diamplifikasi perlu memperhatikan kestabilan genetik dari daerah/urutan nukleotida yang ditargetkan. Perubahan atau hilangnya sebagian urutan target akan berakibat hilangnya reaktivitas. Bagian dari plasmid yang membawa sifat virulensi suatu bakteri adalah salah satu contoh elemen genetik yang potensial tidak stabil. Elemen genetik ini bisa hilang waktu isolai atau pemindahan serial. Untuk mengatasi hal ini sebaiknya amplifikasi segera dilakukan setelah isolasi DNA selesai.
2.2.6. Primers
Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar antara 1°C. Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan primer tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu sama lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA repetitif. Selain itu, faktor homologi urutan nukleotida dengan urutan DNA target sangat mempengaruhi kestabilan ikatan keduanya. Semakin tinggi prosentase homologi semakin stabil ikatan yang terbentuk.
5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´
| | | | | | | | | |
3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´
Gambar4. Bentuk dimer-primer dari sepasang primer
Temperatur annealing sangat tergantung pada primer dengan Tm yang tertentu. Penentuan formula primer ditentukan secara teoritikal oleh Tm asam nukleat. Formula di bawah ini dapat digunakan untuk mengestimasi titik Tm untuk oligonucleotida primer yang diinginkan:
Tm = 81.5 + 16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x 9%G+C) -675/n
Dimana [Na+] adalah konsentrasi molar garam, [Na+]=[K+]; dan n= jumlah basa dalam oligonukleotida.
2.2.7. Taq DNA polymerase
Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95ºC. Biasanya untuk setiap 100μl volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5 unit Taq polymerase. Penggunaan enzim ini harus diperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer -20ºC) dan juga pada saat pengambilan tidak boleh terlalu lama di temperatur ruang, usahakan selalu dalam kotak berisi water-ice. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan kerusakan enzim yang mungkin terjadi akibat pengaruh perubahan temperatur. Taq DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah milik paten asli dari perusahaan Promega. Walaupun pada saat ini telah banyak dikembangkan oleh perusahaan yang lain.
2.2.8. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.
Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan. Penentuan kisaran konsentrasi Mg2+ dapat dilihat pada gambar 5, pada setiap step bervariasi berjarak0.5 mM.
2.2.9. Nucleotides (dNTPs)
Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM. Pada konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.
2.2.10. PCR Thermal Cycler
PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal cycler ini dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama masing-masing alat itu berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.
Gambar6. PCR thermal cycler multi-block system
Alat ini secara tepat meregulasi temperatur dan siklus waktu yang dibutuhkan untuk reprodusibilitas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Seperti telah disebutkan di atas, siklus PCR terbagi atas tiga step utama yaitu DNA denaturation (92-95ºC, selama 30-60 detik), primer annealing (50-64ºC, selama 60-120 detik), dan extention (70-72ºC, selama 30-120 detik). Siklus ini berulang 20-35 kali. Siklus utama ini diawali terlebih dahulu oleh dengan hot-start misal 94ºC selama 5 menit (lihat tabel 2 diatas). Langkah ini dilakukan untuk memaksimalkan proses denaturasi DNA template, karena apabila denaturasi tidak sempurna akan menyebabkan kegagalan proses PCR. Setelah siklus utama berakhir, maka ditambah program final extension dengan temperatur 70-72ºC selama 7-10 menit.
2.3. Bioinformatika
2.3.1. Pengertian Bioinformatika
Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk mengelola dan menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika, statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino serta informasi yang berkaitan dengannya. Contoh topik uttama bidang ini meliputi basis data untuk mengelola informasi biologis, penyejajaran sekuens, prediksi struktur untuk meramalakan bentuk struktur protein maupun struktur sekunder RNA, analisis filogenetik, dan analisis ekspresi gen
2.3.2. Sejarah Bioinformatika
Istilah bioinformatika mulai dikemukakan pada pertengan era 1980-an untuk mengacu pada penerapan komputer dalam biologi. namun demikian, penerapan bidang-bidang dalam bioinformatika seperti pada pembuatan basis data dan pengembangan algoritma untuk analisis sekuens biologis sudah dilakukan sejak tahun 1960-an Kemajuan tekhnik biologi molekular dalam mengungkap sekuens biologis dari protein awal 1950-an dan asam nukleat sejak 1960-an mengawali perkembangan basis data dan tekhnik analisis sekuens biologis. Basis data sekuens protein mulai dikembangkan pada tahin 1960-an di Amerika Serikat, sementara basis data sekuens DNA dikembangkan pada 1970-an di Amerika Serikat dan Jerman. Penemuan tekhnik sekuensing DNA yang lebih cepat pada pertengahan 1970-an menjadi landasan terjadinya ledakkan jumlah sekuens DNA yang berhasil diungkapkan pada 1980-an dan 1990-an, menjadi salah satu pembuka jalan baig proyek-proyek pengungkapan genom, meningkatkan kebutuhan akan pengelolaan dan analisis sekuens, dan pada akhirnya menyebabkan lahirnya bioinformatika. Perkembangan internet juga mendukung berkembangnya bioinformatika. Basis data bioinformatika yang terhubung melalui internet memudahkan ilmuwan hasil sekuensing ke dalam basis dara tersebut mauoun memperoleh sekuens biologis sebagai bahan analisis. Selain itu, penyebaran program-program aplikasi bioinformatika melalui internet memudahkan ilmuwan mengakses program-program tersebut dan kemudian memudahkan pengembangannya.
2.3.3. Penerapan utama bioinformatika
Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpanya, basis data sekuens biologis berupa basis data primer asam nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein, dan basis data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat. Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank (Amerika Serikat), EMBL (Eropa), dan DDBJ(en) (DNA Data Bank of Japan, Jepang). Ketiga basis data tersebut bekerja sama dan bertukar data secara harian untuk menjaga keluasan cakupan masing-masing basis data. Sumber utama data sekuens asam nukleat adalah submisi langsung dari periset individual, proyek sekuensing genom, dan pendaftaran paten. Selain berisi sekuens asam nukleat, entri dalam basis data sekuens asam nukleat umumnya mengandung informasi tentang jenis asam nukleat (DNA atau RNA), nama organisme sumber asam nukleat tersebut, dan pustaka yang berkaitan dengan sekuens asam nukleat tersebut.
Sementara itu, contoh beberapa basis data penting yang menyimpan sekuens primer protein adalah PIR (Protein Information Resource, Amerika Serikat), Swiss-Prot (Eropa), dan TrEMBL (Eropa). Ketiga basis data tersebut telah digabungkan dalam UniProt (yang didanai terutama oleh Amerika Serikat). Entri dalam UniProt mengandung informasi tentang sekuens protein, nama organisme sumber protein, pustaka yang berkaitan, dan komentar yang umumnya berisi penjelasan mengenai fungsi protein tersebut.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST (BLAST search) pada basis data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.
PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) adalah basis data tunggal yang menyimpan model struktural tiga dimensi protein dan asam nukleat hasil penentuan eksperimental (dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR dan mikroskopi elektron). PDB menyimpan data struktur sebagai koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi atom-atom dalam protein ataupun asam nukleat.
Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpanya, basis data sekuens biologis berupa basis data primer asam nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein, dan basis data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat. Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank (Amerika Serikat), EMBL (Eropa), dan DDBJ(en) (DNA Data Bank of Japan, Jepang). Ketiga basis data tersebut bekerja sama dan bertukar data secara harian untuk menjaga keluasan cakupan masing-masing basis data. Sumber utama data sekuens asam nukleat adalah submisi langsung dari periset individual, proyek sekuensing genom, dan pendaftaran paten. Selain berisi sekuens asam nukleat, entri dalam basis data sekuens asam nukleat umumnya mengandung informasi tentang jenis asam nukleat (DNA atau RNA), nama organisme sumber asam nukleat tersebut, dan pustaka yang berkaitan dengan sekuens asam nukleat tersebut.
Sementara itu, contoh beberapa basis data penting yang menyimpan sekuens primer protein adalah PIR (Protein Information Resource, Amerika Serikat), Swiss-Prot (Eropa), dan TrEMBL (Eropa). Ketiga basis data tersebut telah digabungkan dalam UniProt (yang didanai terutama oleh Amerika Serikat). Entri dalam UniProt mengandung informasi tentang sekuens protein, nama organisme sumber protein, pustaka yang berkaitan, dan komentar yang umumnya berisi penjelasan mengenai fungsi protein tersebut.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST (BLAST search) pada basis data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.
PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) adalah basis data tunggal yang menyimpan model struktural tiga dimensi protein dan asam nukleat hasil penentuan eksperimental (dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR dan mikroskopi elektron). PDB menyimpan data struktur sebagai koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi atom-atom dalam protein ataupun asam nukleat.
2.3.4. Penyejajaran Sekuens
Penyejajaran sekuens (sequence alignment) adalah proses penyusunan/pengaturan dua atau lebih sekuens sehingga persamaan sekuens-sekuens tersebut tampak nyata. Hasil dari proses tersebut juga disebut sebagai sequence alignment atau alignment saja. Baris sekuens dalam suatu alignment diberi sisipan (umumnya dengan tanda "–") sedemikian rupa sehingga kolom-kolomnya memuat karakter yang identik atau sama di antara sekuens-sekuens tersebut. Berikut adalah contoh alignment DNA dari dua sekuens pendek DNA yang berbeda, "ccatcaac" dan "caatgggcaac" (tanda "|" menunjukkan kecocokan atau match di antara kedua sekuens). Sequence alignment merupakan metode dasar dalam analisis sekuens. Metode ini digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common ancestor). Ketidakcocokan (mismatch) dalam alignment diasosiasikan dengan proses mutasi, sedangkan kesenjangan (gap, tanda "–") diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi. Sequence alignment memberikan hipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-sekuens tersebut. Misalnya, kedua sekuens dalam contoh alignment di atas bisa jadi berevolusi dari sekuens yang sama "ccatgggcaac". Dalam kaitannya dengan hal ini, alignment juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dipertahankan (conserved) selama evolusi dalam sekuens-sekuens protein, yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut bisa jadi penting bagi struktur atau fungsi protein tersebut.
Selain itu, sequence alignment juga digunakan untuk mencari sekuens yang mirip atau sama dalam basis data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan algoritma heuristik dalam penyusunan alignment. Beberapa metode alignment lain yang merupakan pendahulu BLAST adalah metode "Needleman-Wunsch" dan "Smith-Waterman". Metode Needleman-Wunsch digunakan untuk menyusun alignment global di antara dua atau lebih sekuens, yaitu alignment atas keseluruhan panjang sekuens tersebut. Metode Smith-Waterman menghasilkan alignment lokal, yaitu alignment atas bagian-bagian dalam sekuens. Kedua metode tersebut menerapkan pemrograman dinamik (dynamic programming) dan hanya efektif untuk alignment dua sekuens (pairwise alignment)
Selain itu, sequence alignment juga digunakan untuk mencari sekuens yang mirip atau sama dalam basis data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan algoritma heuristik dalam penyusunan alignment. Beberapa metode alignment lain yang merupakan pendahulu BLAST adalah metode "Needleman-Wunsch" dan "Smith-Waterman". Metode Needleman-Wunsch digunakan untuk menyusun alignment global di antara dua atau lebih sekuens, yaitu alignment atas keseluruhan panjang sekuens tersebut. Metode Smith-Waterman menghasilkan alignment lokal, yaitu alignment atas bagian-bagian dalam sekuens. Kedua metode tersebut menerapkan pemrograman dinamik (dynamic programming) dan hanya efektif untuk alignment dua sekuens (pairwise alignment)
Clustal adalah program bioinformatika untuk alignment multipel (multiple alignment), yaitu alignment beberapa sekuens sekaligus. Dua varian utama Clustal adalah ClustalW dan ClustalX. Metode lain yang dapat diterapkan untuk alignment sekuens adalah metode yang berhubungan dengan Hidden Markov Model ("Model Markov Tersembunyi", HMM). HMM merupakan model statistika yang mulanya digunakan dalam ilmu komputer untuk mengenali pembicaraan manusia (speech recognition). Selain digunakan untuk alignment, HMM juga digunakan dalam metode-metode analisis sekuens lainnya, seperti prediksi daerah pengkode protein dalam genom dan prediksi struktur sekunder protein.
2.3.5. Prediksi Struktur Protein
Secara kimia/fisika, bentuk struktur protein diungkap dengan kristalografi sinar-X ataupun spektroskopi NMR, namun kedua metode tersebut sangat memakan waktu dan relatif mahal. Sementara itu, metode sekuensing protein relatif lebih mudah mengungkapkan sekuens asam amino protein. Prediksi struktur protein berusaha meramalkan struktur tiga dimensi protein berdasarkan sekuens asam aminonya (dengan kata lain, meramalkan struktur tersier dan struktur sekunder berdasarkan struktur primer protein). Secara umum, metode prediksi struktur protein yang ada saat ini dapat dikategorikan ke dalam dua kelompok, yaitu metode pemodelan protein komparatif dan metode pemodelan de novo.
Pemodelan protein komparatif (comparative protein modelling) meramalkan struktur suatu protein berdasarkan struktur protein lain yang sudah diketahui. Salah satu penerapan metode ini adalah pemodelan homologi (homology modelling), yaitu prediksi struktur tersier protein berdasarkan kesamaan struktur primer protein. Pemodelan homologi didasarkan pada teori bahwa dua protein yang homolog memiliki struktur yang sangat mirip satu sama lain. Pada metode ini, struktur suatu protein (disebut protein target) ditentukan berdasarkan struktur protein lain (protein templat) yang sudah diketahui dan memiliki kemiripan sekuens dengan protein target tersebut. Selain itu, penerapan lain pemodelan komparatif adalah protein threading yang didasarkan pada kemiripan struktur tanpa kemiripan sekuens primer. Latar belakang protein threading adalah bahwa struktur protein lebih dikonservasi daripada sekuens protein selama evolusi; daerah-daerah yang penting bagi fungsi protein dipertahankan strukturnya. Pada pendekatan ini, struktur yang paling kompatibel untuk suatu sekuens asam amino dipilih dari semua jenis struktur tiga dimensi protein yang ada. Metode-metode yang tergolong dalam protein threading berusaha menentukan tingkat kompatibilitas tersebut.
Dalam pendekatan de novo atau ab initio, struktur protein ditentukan dari sekuens primernya tanpa membandingkan dengan struktur protein lain. Terdapat banyak kemungkinan dalam pendekatan ini, misalnya dengan menirukan proses pelipatan (folding) protein dari sekuens primernya menjadi struktur tersiernya (misalnya dengan simulasi dinamika molekular), atau dengan optimisasi global fungsi energi protein. Prosedur-prosedur ini cenderung membutuhkan proses komputasi yang intens, sehingga saat ini hanya digunakan dalam menentukan struktur protein-protein kecil. Beberapa usaha telah dilakukan untuk mengatasi kekurangan sumber daya komputasi tersebut, misalnya dengan superkomputer (misalnya superkomputer Blue Gene dari IBM) atau komputasi terdistribusi (distributed computing, misalnya proyek Folding@home) maupun komputasi grid.
Pemodelan protein komparatif (comparative protein modelling) meramalkan struktur suatu protein berdasarkan struktur protein lain yang sudah diketahui. Salah satu penerapan metode ini adalah pemodelan homologi (homology modelling), yaitu prediksi struktur tersier protein berdasarkan kesamaan struktur primer protein. Pemodelan homologi didasarkan pada teori bahwa dua protein yang homolog memiliki struktur yang sangat mirip satu sama lain. Pada metode ini, struktur suatu protein (disebut protein target) ditentukan berdasarkan struktur protein lain (protein templat) yang sudah diketahui dan memiliki kemiripan sekuens dengan protein target tersebut. Selain itu, penerapan lain pemodelan komparatif adalah protein threading yang didasarkan pada kemiripan struktur tanpa kemiripan sekuens primer. Latar belakang protein threading adalah bahwa struktur protein lebih dikonservasi daripada sekuens protein selama evolusi; daerah-daerah yang penting bagi fungsi protein dipertahankan strukturnya. Pada pendekatan ini, struktur yang paling kompatibel untuk suatu sekuens asam amino dipilih dari semua jenis struktur tiga dimensi protein yang ada. Metode-metode yang tergolong dalam protein threading berusaha menentukan tingkat kompatibilitas tersebut.
Dalam pendekatan de novo atau ab initio, struktur protein ditentukan dari sekuens primernya tanpa membandingkan dengan struktur protein lain. Terdapat banyak kemungkinan dalam pendekatan ini, misalnya dengan menirukan proses pelipatan (folding) protein dari sekuens primernya menjadi struktur tersiernya (misalnya dengan simulasi dinamika molekular), atau dengan optimisasi global fungsi energi protein. Prosedur-prosedur ini cenderung membutuhkan proses komputasi yang intens, sehingga saat ini hanya digunakan dalam menentukan struktur protein-protein kecil. Beberapa usaha telah dilakukan untuk mengatasi kekurangan sumber daya komputasi tersebut, misalnya dengan superkomputer (misalnya superkomputer Blue Gene dari IBM) atau komputasi terdistribusi (distributed computing, misalnya proyek Folding@home) maupun komputasi grid.
2.3.6. Analisis ekspresi gen
Ekspresi gen dapat ditentukan dengan mengukur kadar mRNA dengan berbagai macam teknik (misalnya dengan microarray ataupun Serial Analysis of Gene Expression ["Analisis Serial Ekspresi Gen", SAGE]). Teknik-teknik tersebut umumnya diterapkan pada analisis ekspresi gen skala besar yang mengukur ekspresi banyak gen (bahkan genom) dan menghasilkan data skala besar. Metode-metode penggalian data (data mining) diterapkan pada data tersebut untuk memperoleh pola-pola informatif. Sebagai contoh, metode-metode komparasi digunakan untuk membandingkan ekspresi di antara gen-gen, sementara metode-metode klastering (clustering) digunakan untuk mempartisi data tersebut berdasarkan kesamaan ekspresi gen.
2.4. Isolasi Genom DNA
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA.
2.5. Electrophoresis
Istilah elektroforesis digunakan untuk menggambarkan migrasi partikel bermuatan di bawah pengaruh medan listrik. Dengan demikian elektroforesis gel mengacu adalah teknik di mana molekul dipaksa di rentang gel, didorong oleh arus listrik. Pada kedua ujung gel terdapat elektroda diaktifkan yang menyediakan pendorong utama. Oleh karena itu sifat molekul khususnya milik kelompok ionisable, menentukan seberapa cepat medan listrik dapat menggerakkan molekul melalui media agar-agar. Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencing diinjeksikan secara elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif (gambar 4). Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.
Salah satu aplikasi yang sangat penting bagi elektroforesis gel dalam DNA Teknologi. Bioteknologi telah selama ribuan tahun telah digunakan oleh orang yang telah menggunakan ragi untuk membuat tepung menjadi roti dan anggur menjadi anggur. Kami sekarang menggunakan bioteknologi untuk mempelajari proses dasar kehidupan, diagnosa penyakit, dan mengembangkan pengobatan baru untuk penyakit. Beberapa alat bioteknologi merupakan komponen alami dari sel-sel. Sebagai contoh enzim restriksi yang dibuat oleh bakteri untuk melindungi diri dari virus. Mereka membunuh DNA virus oleh pemotongan itu di tempat-tempat tertentu. DNA ligase adalah suatu enzim yang ada di semua sel dan bertanggung jawab untuk bergabung bersama untai DNA. enzim restriksi dapat digunakan untuk memotong DNA pada urutan tertentu disebut situs pengakuan. Mereka kemudian bergabung dengan alur dipotong dengan DNA ligase untuk kombinasi baru dari gen. DNA rekombinan urutan mengandung gen dari dua atau lebih organisme.
Teknik ini telah memungkinkan peneliti untuk mendapatkan kemampuan untuk mendiagnosa penyakit seperti anemia sel sabit, cystic fibrosis, dan chorea Huntington pada awal perjalanan penyakit ini. Banyak peneliti juga menerapkan teknik-teknik bioteknologi untuk menemukan pengobatan baru untuk penyakit genetik. teknologi DNA telah memicu kemajuan penelitian di hampir semua bidang biologi. Saat ini ratusan produk yang bermanfaat yang dihasilkan oleh rekayasa genetika. Hal ini telah menjadi rutin untuk menggabungkan gen dari sumber yang berbeda, spesies biasanya berbeda - dalam tabung reaksi, dan kemudian transfer ini DNA rekombinan ke sel-sel hidup di tempat yang dapat direplikasi dan diekspresikan. Prestasi yang paling penting yang dihasilkan dari teknologi DNA rekombinan telah kemajuan dalam pemahaman dasar kita tentang biologi molekular eukariotik. Misalnya, hanya melalui penggunaan teknik gen-splicing memiliki rincian eukaryotics pengaturan gen dan peraturan telah dibuka untuk analisis eksperimental.
Elektroforesis gel adalah salah satu alat pokok dalam biologi molekular dan nilai penting dalam banyak aspek manipulasi genetik dan belajar. Salah satu penggunaan adalah identifikasi molekul DNA tertentu oleh pola band mereka menghasilkan dalam elektroforesis gel setelah dipotong dengan berbagai enzim restriksi. Viral DNA, DNA plasmid, dan segmen tertentu DNA kromosom semua dapat diidentifikasi dengan cara ini. Penggunaan lainnya adalah isolasi dan pemurnian fragmen individu yang mengandung gen menarik, yang dapat pulih dari gel dengan penuh aktivitas biologis. Gel elektroforesis memungkinkan untuk menentukan perbedaan genetik dan hubungan evolusi di antara spesies tanaman dan hewan. Menggunakan teknologi ini adalah mungkin untuk memisahkan dan mengidentifikasi molekul protein yang berbeda dengan sesedikit asam amino tunggal.
Teknik ini telah memungkinkan peneliti untuk mendapatkan kemampuan untuk mendiagnosa penyakit seperti anemia sel sabit, cystic fibrosis, dan chorea Huntington pada awal perjalanan penyakit ini. Banyak peneliti juga menerapkan teknik-teknik bioteknologi untuk menemukan pengobatan baru untuk penyakit genetik. teknologi DNA telah memicu kemajuan penelitian di hampir semua bidang biologi. Saat ini ratusan produk yang bermanfaat yang dihasilkan oleh rekayasa genetika. Hal ini telah menjadi rutin untuk menggabungkan gen dari sumber yang berbeda, spesies biasanya berbeda - dalam tabung reaksi, dan kemudian transfer ini DNA rekombinan ke sel-sel hidup di tempat yang dapat direplikasi dan diekspresikan. Prestasi yang paling penting yang dihasilkan dari teknologi DNA rekombinan telah kemajuan dalam pemahaman dasar kita tentang biologi molekular eukariotik. Misalnya, hanya melalui penggunaan teknik gen-splicing memiliki rincian eukaryotics pengaturan gen dan peraturan telah dibuka untuk analisis eksperimental.
Elektroforesis gel adalah salah satu alat pokok dalam biologi molekular dan nilai penting dalam banyak aspek manipulasi genetik dan belajar. Salah satu penggunaan adalah identifikasi molekul DNA tertentu oleh pola band mereka menghasilkan dalam elektroforesis gel setelah dipotong dengan berbagai enzim restriksi. Viral DNA, DNA plasmid, dan segmen tertentu DNA kromosom semua dapat diidentifikasi dengan cara ini. Penggunaan lainnya adalah isolasi dan pemurnian fragmen individu yang mengandung gen menarik, yang dapat pulih dari gel dengan penuh aktivitas biologis. Gel elektroforesis memungkinkan untuk menentukan perbedaan genetik dan hubungan evolusi di antara spesies tanaman dan hewan. Menggunakan teknologi ini adalah mungkin untuk memisahkan dan mengidentifikasi molekul protein yang berbeda dengan sesedikit asam amino tunggal.
Gel Elektroforesis adalah proses di mana molekul (seperti protein, DNA, atau fragmen RNA) dapat dipisahkan menurut ukuran dan muatan listrik dengan menerapkan arus listrik kepada mereka. Pasukan saat ini molekul-molekul melalui pori-pori di dalam lapisan tipis gel, sebuah perusahaan substansi seperti jelly. Gel dapat dibuat sedemikian rupa sehingga pori-pori yang hanya dimensi yang tepat untuk memisahkan molekul-molekul dalam jarak tertentu dari ukuran dan bentuk. fragmen yang lebih kecil biasanya perjalanan lebih jauh daripada yang besar. Proses ini terkadang disebut elektroforesis gel. .
elektroforesis gel agarosa adalah metode yang digunakan dalam biokimia dan biologi molekuler untuk memisahkan populasi campuran DNA dan RNA dengan fragmen panjang, atau protein yang terpisah oleh muatan [1] molekul asam nukleat. dipisahkan dengan menerapkan medan listrik untuk memindahkan bermuatan negatif molekul melalui agarosa matriks. molekul yang lebih pendek bergerak lebih cepat dan bermigrasi jauh dari yang lama karena molekul-molekul yang lebih pendek lebih mudah bermigrasi melalui pori-pori gel. Fenomena ini disebut pemisahan. [2] Protein dipisahkan oleh muatan dalam agarosa karena pori-pori gel terlalu besar untuk saringan protein.
elektroforesis gel agarosa adalah metode yang digunakan dalam biokimia dan biologi molekuler untuk memisahkan populasi campuran DNA dan RNA dengan fragmen panjang, atau protein yang terpisah oleh muatan [1] molekul asam nukleat. dipisahkan dengan menerapkan medan listrik untuk memindahkan bermuatan negatif molekul melalui agarosa matriks. molekul yang lebih pendek bergerak lebih cepat dan bermigrasi jauh dari yang lama karena molekul-molekul yang lebih pendek lebih mudah bermigrasi melalui pori-pori gel. Fenomena ini disebut pemisahan. [2] Protein dipisahkan oleh muatan dalam agarosa karena pori-pori gel terlalu besar untuk saringan protein.
§ Estimasi ukuran molekul DNA berikut restriksi enzim pencernaan, misalnya pembatasan dalam pemetaan DNA kloning. Analisis produk PCR, misalnya dalam diagnosis genetika molekuler atau genetik fingerprinting
§ Pemisahan DNA genomik Selatan dibatasi sebelum transfer, atau RNA sebelum mentransfer Utara.
gel agarosa mudah cor dan ditangani dibandingkan dengan matriks lain dan asam nukleat tidak kimia diubah selama elektroforesis. Sampel juga mudah ditemukan. Setelah percobaan selesai, gel yang dihasilkan dapat disimpan dalam sebuah kantong plastik di kulkas. Ada batas untuk teknik elektroforesis. Sejak saat melewati gel menyebabkan pemanasan, gel bisa meleleh selama elektroforesis. Elektroforesis dilakukan dalam larutan buffer untuk mengurangi perubahan pH karena medan listrik, yang penting karena muatan DNA dan RNA tergantung pada pH, tetapi berjalan terlalu lama dapat menghabiskan kapasitas buffering dari solusi. Selanjutnya, berbagai persiapan bahan genetik tidak dapat bermigrasi secara konsisten satu sama lain, untuk alasan morfologi atau lainnya. Sunting Faktor-faktor yang mempengaruhi migrasi asam nukleat
Faktor paling penting adalah panjang dari molekul DNA, molekul kecil perjalanan jauh. Tapi konformasi molekul DNA juga faktor. Untuk menghindari masalah ini molekul linier biasanya dipisahkan, fragmen DNA biasanya dari pembatasan mencerna, linear DNA produk PCR, atau RNA. Meningkatkan konsentrasi gel agarosa dari migrasi mengurangi kecepatan dan memungkinkan pemisahan molekul DNA yang lebih kecil. Semakin tinggi tegangan, semakin cepat bergerak DNA. Tapi tegangan dibatasi oleh fakta bahwa memanaskan dan akhirnya menyebabkan gel mencair. Tegangan tinggi juga menurunkan resolusi (di atas sekitar 5 sampai 8 / cm V).
Faktor paling penting adalah panjang dari molekul DNA, molekul kecil perjalanan jauh. Tapi konformasi molekul DNA juga faktor. Untuk menghindari masalah ini molekul linier biasanya dipisahkan, fragmen DNA biasanya dari pembatasan mencerna, linear DNA produk PCR, atau RNA. Meningkatkan konsentrasi gel agarosa dari migrasi mengurangi kecepatan dan memungkinkan pemisahan molekul DNA yang lebih kecil. Semakin tinggi tegangan, semakin cepat bergerak DNA. Tapi tegangan dibatasi oleh fakta bahwa memanaskan dan akhirnya menyebabkan gel mencair. Tegangan tinggi juga menurunkan resolusi (di atas sekitar 5 sampai 8 / cm V).
Elektroforesis DNA 'digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan ukuran. Jenis gel paling sering digunakan untuk elektroforesis DNA agarosa (untuk molekul DNA yang relatif besar) dan poliakrilamida (untuk resolusi tinggi fragmen DNA pendek). Yang pertama juga kadang-kadang disebut sebagai kapal selam karena elektroforesis gel yang terendam dalam buffer. The buffer digunakan untuk pemisahan adalah Tris-Borat-EDTA atau Tris-Asetat-EDTA dan DNA bermigrasi relatif terhadap ukuran: kecil fragmen bergerak lebih cepat melalui matriks gel dan fragmen yang bergerak lebih lambat. Setelah pemisahan, gel dapat diwarnai atau ditransfer (Southern blotting). pemisahan DNA biasanya dideteksi dengan pewarna yang mengikat ke molekul dan biasanya dilihat di bawah sinar UV. asam nukleat dapat ditransfer dari gel matriks membran kapiler lembar melalui transfer atau listrik untuk menyelidik.
DNA fragmen dalam kisaran 100 bp hingga 20 kb biasanya dipisahkan dalam gel agarosa menggunakan gaya elektroforesis unit kapal selam. Hoefer menawarkan 8 ukuran unit kapal selam untuk hasil cepat atau throughput tinggi.
DNA fragmen dalam kisaran 100 bp hingga 20 kb biasanya dipisahkan dalam gel agarosa menggunakan gaya elektroforesis unit kapal selam. Hoefer menawarkan 8 ukuran unit kapal selam untuk hasil cepat atau throughput tinggi.
2.6. Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.
Sebuah sampel biologis dapat diperoleh dari suatu tindak kejahatan dalam bentuk darah atau noda air mani atau darah segar dari seorang tersangka yang berisi beberapa unsur di samping DNA. Molekul DNA harus dipisahkan dari materi sel lain sebelum diuji. Sel-sel protein terbungkus melindungi DNA di dalam lingkungan sel dapat menghalangi kemampuan analisa DNA. Sementara itu metode ekstrasi DNA dapat dikembangkan untuk memisahkan protein-protein dan materi sel-sel yang lain dari molekul-molekul DNA. Sebagai tambahan kuantitas dan kualitas DNA sering perlu diukur sebelum kelanjutan lebih lanjut dengan prosedur analitis untuk memastikan hasil yang optimal. Ada tiga teknik utama yang digunakan saat ini untuk ekstrasi DNA pada laboratorium forensik DNA: ektraksi organik, ekstraksi Chelex, dan FTA paper (gambar 3.1). Ekstraksi eksak atau masam-macam prosedur isolasi DNA tergantung pada bukti-bukti tipe biologis yang akan diuji. Sebagai contoh darah utuh harus diperlakukan dengan cara yang berbeda dari suatu noda darah atau suatu fragmen tulang.
Ekstraksi organik, kadang-kadang dikenal sebagai ekstraksi zat asam karbol choloform, telah digunakan untuk waktu yang lama dan mungkin telah digunakan untuk situasi di mana baik RFLP atau PCR dilakukan. Bobot molekular tinggi DNA, yang mana penting bagi metoda RFLP, mungkin diperoleh secara paling efektif dengan ekstraksi organik.
Metoda Chelex dari ekstraksi DNA lebih cepat dibandingkan dengan metode ekstraksi organik. Sebagai tambahan, metoda Chelex membutuhkan lebih banyak langkah dan kebanyakan langkah itu digunakan untuk mengkontaminasi sampel ke sampel. Bagaimanapun hal itu menghasilkan DNA tunggal sebagai hasil proses ekstraksi dan oleh karena itu hanya yang bermanfaat untuk prosedur pengujian yang berbasis PCR.
Semua contoh harus secara hati-hati ditangani dengan mengabaikan metoda ekstraksi DNA untuk menghindari pencemaran sampel ke kesampel atau pengenalan tentang tambahan DNA. Proses ekstraksi memungkinkan di mana contoh DNA jadi lebih peka pada pencemaran di laboratorium dibanding pada waktu lain dalam proses analisa forensik DNA. Dengan suatu alasan laboratorium-laboratorium biasa memproses sampel-sampel petunjuk pada waktu yang berbeda dan kadang-kadang dengan loksi yang tidak sama dari dimana sampel tersebut diambil.
Metoda yang populer untuk persiapan pengambilan referensi sampel adalah dengan menggunakan noda darah dengan mengoleskannya ke kain kapas, dikenal dengan suatu carikan, dengan menghasilkan bulatan kira-kira 1 cm2 pada kain kapas tersebut, dengan rata-rata 70.000-80.000 sel darah putih dan menghasilkan rata-rata 500ng DNA genomic. Hasil nyata akan bervariasi dengan jumlah sel-sel darah putih yang akan menunjukkan sampel dan efisiensi proses ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA disimpan secara khusus pda suhu -20oC, atau bahkan pada suhu -80oC pada penyimpanan dalam waktu lama, untuk menjaga aktifitas inti. Nucleas-nucleas adalah enzim-enzim (protein) yang diketemukan di dalam sel-sel turunan DNA untuk memungkinkan pendauran ulang menyangkut komponen-komponen nucleotide. Nucleases memerlukan magnesium untuk bekerja dengan baik sehingga salah satu pengujian untuk mencegah mereka dari mencerna DNA di dalam darah adalah menggunakan tabung purple-topped yang berisi bahan pengawet darah yang dikenal sebagai EDTA. EDTA meliputi, atau membalut, semua magnesium bebas dengan begitu mencegah nucleases menhancurkan DNA di dalam contoh darah yang dikumpulkan.
Ekstraksi organik melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. Pertama, sodium Dodecylsulfate (SDS) dan Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka dinding sel sepanjang protein yang melindungi molekul DNA selagi mereka ada di dalam kromosom. Selanjutnya campuran phenol/cloroform ditambahkan untuk memisahkan protein dari DNA. DNA menjadi lebih dapat larut di dalam air yang mengandung campuran organic-aqueous. Ketika proses sentrifuge, bekas peninggalan protein dan selular yang tak dikehendaki dipisahkan dari tahap yang mengandung air dan menggandakan molekul DNA sehingga dapat ditransfer dengan baik untuk dianalisa. Beberapa protokol melibatkan dialisa centricon 100 (Millipore, Billerica, MA) dan konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk memindahkan heme inhibitors (Comey et al 1994). Sementara metoda ekstraksi bekerja dengan baik untuk recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini adalah waktu menggunakan bahan kimia yang penuh resiko dan memerlukan contoh untuk ditransfer antara banyak tabung (faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi)
2.6.2. Proses Penarikan Chelex
Sebuah prosedur alternatif untuk penarikan DNA yang telah terkenal dikalangan ahli forensik adalah penggunaan dari suspensi resin kombinasi yang dapat ditambahkan langsung pada sampel (misalnya, darah, bercak darah, atau semen). Diperkenalkan kepada komunitas forensik DNA pada tahun 1991, chelexR 100 (Lab Bio-Rad, Hercules, CA) adalah pertukaran ion resin yang ditambahkan sebagai suspensi pada beberapa sampel (Walsh et.al.1991). chelex terdiri dari styrene divinylbenzene copolimers mengandung sepasang ion iminodiacetate yang bereaksi sebagai grup-grup kombinasi dalam ikatan ion metal polivalen seperti magnesium. Serupa dengan pengisian besi untuk menjadi sebuah magnet, beberapa ion magnesium tertarik dan terlempar keatas. Dengan memindahkan magnesium dari reaksi tersebut, DNA menghancurkan enzim-enzim dikenal sebagai nukleus yang tidak diaktifkan dan molekul-molekul DNA yang terlindungi.
Pada sebagian besar protokol, sampel biologis seperti bercak darah ditambahkan sampai dengan 5% suspensi chelex dan dididihkan selama beberapa menit untuk memecah sel-sel dan melepaskan DNA. Sebuah permulaan, langkah pencucian sebelumnya sangat membantu untuk menghilangkan kontaminasi dan hambatan yang mungkin timbul seperti heme dan beberapa protein (Willard et.al. 1998). Pemanasan sampai temperatur 1000 C memecahkan DNA protein sel sama seperti mengacaukan membran sel dan menghancurkan protein sel setelah pemusingan didalam mesin sentrifuse untuk mendorong resin chelex dan sisa-sisa selular kedasar tabung reaksi, cairan bagian atas setelah proses pengendapan dihilangkan dan dapat ditambahkan langsung ke reaksi pengerasan PCR.
2.7. Analisis sequen DNA dengan Blast
Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
2.7.1. Sequencing Chemistries
Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.
2.7.2. Sequencing menggunakan Dye Primers
Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakan dye fluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).
2.7.3. Sequencing menggunakan Dye Terminators
DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya (gambar 3)3.3. Metodelogi
3.3.1. Visualisasi Ekstraksi DNA
3.3.1.1. Isolasi DNA Prokariot
1. Dalam kondidi aseptis, isi tabung apendorf 1,5 ml dengan aquadest
2. Kemudian ambil 1 ose kultur bakteri dan inokulasikan kedalam tabung apendorf tersebut
3. Suspense bakteri tersebut kemudian dimasukkan kedalam freezer
4. Diamkan hingga mengkristal
5. Sementara itu panaskan air hingga suhu air mencapai 900C
6. Sementara itu suspense mengkristal, rendam tabung apendorf di air selama 10 menit
7. Ulangi langkah diatas sebanyak tiga kali
3.3.1.2. Isolasi DNA Euakriot
- Ambil 1 buah strawberry, kemudian dibelah / dibagi menjadi 2 bagian.
- Letakkan sebagian strawberry kedalam plastic ziplock dan remas-remas dengan jari tangan hingga menjadi cairan juice.
- Tambahkan 10 ml buffer lisis kedalam plastic dan tutup kembali.
- Lanjutkan meremas plastic kurang lebih 2-3 menit hingga bercampur/ homogeny dengan larutan juice
- Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit
- Buang saringan dan ekstrak yang ada
- Teteskan sebanyak 2-4 tetes enzim ke dalam tabung yang telah berisi strawberi dan larutan.
- Tuangkan sebanyak 30 ml 95 % alcohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50 ml
Lalu tuangkan larutan yang telah disaring kedalam tabung, tutup tabungnya
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
4.1.1. Visualisasi Ekstraksi DNA
Pada visualisasi ekstraksi dari DNA ini didapatkan beberapa hasil dari praktikum isolasi genom DNA diantaranya yaitu:
a. Isolasi DNA Prokariot
Pada isolasi DNA prokariot didapatkan dari sampel DNA, dengan suspense mengkristal setelah dimasukkan kedalam freezer
b. Isolasi DNA Eukariot
Pada isolasi DNA eukariot didapatkan hasil, DNA naik keatas setelah diberi alcohol dengan warna dari DNA itu sendiri berwarna bening dan berupa benang – benang putih.
4.2. Pembahasan
4.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA
Pada ekstraksi suatu DNA, terdapat dua teknik dari isolasi DNA yaitu isolasi DNA prokariot dan isolasi DNA eukariot. materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Karena ukuran relatif kecil genom prokariotik, banyak urutan genom lengkap untuk berbagai bakteri dan archaea telah dipublikasikan selama beberapa tahun terakhir. Akibatnya, kita mulai mengerti banyak tentang anatomi genom prokariotik, dan dalam banyak hal kita tahu lebih banyak tentang organisme daripada kita tentang eukariota. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak), sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi DNA ini kita mendapatkan DNA yang belum benar-benar murni. Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua sel mempunyai membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang membentuk penghalang memisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. pada DNA terdapat didalam suatu sel sehingga untuk emngisolasi dari suatu DNA, harus dilakukan pemecahan sel secara fisik yang diantaranya yaitu seperti mechanical destruption, liquid homozigation, sonofikasi, freeze dan manual grinding.
4.2.2. Analisis sequen DNA dengan Blast
Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science.Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal, dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Pada kali ini untuk analisis sequen DNA dengan menggunakan BLAST. Dengan melakukan analisis sekuensing dari DNA, maka dapat diketahui dari jenis – jenis bakteri dan sumber atau asal dari suatu bakteri tersebut. Untuk pemilihan bakteri pada analisis sekuensing DNA ini, pemilihanya dilakukan secara random atau acak tidak berdasarkan ketentuan secara urut. Sedangkan untuk penetuan dari sequencing DNA ini diproses dengan progam bioinformatika, dengan progam tersebut maka akan diketahui dari pohon filogenik dari suatu bakteri yang dimasukan kedalam pemrosesan data tersebut. Data dari suatu DNA ini didapat dari GenBank.
4.2.3. Identifikasi Sekuen Menggunakan Program BioInformatika
Pada proses identifikasi DNA dengan menggunakan progam bioinformatika ini untuk menentukan atau mengetahui dari tingkat hubungan dari kekerabatan dari suatu mikroorganisme. Dengan pengolahan data dari hasil sekuensing DNA tersebut maka dapat dihasilkan berupa pohon filogenetik, yang tujuanya juntuk membandingkan dari hasi sekuensing yang didapat pada sekuensing DNA. Dari analisis filogenetik terlihat beberapa bakteri yang mempunyai kekerabatan terdekat seperti pada jenis bakteri Brugia malayi, Plectus murrayi, Theobroma cacao KZ0ACAC, Tamarix hispida clone, Theobroma cacao, Tamarix hispida dan masih banyak yang mempunyai tingkat kekerabatan terdekat antar suatu bakteri. Dari hasil identifikasi bakteri yang didapat dengan menggunakan progam bioinformatika, sumber dari bakteri tersebut rata – rata berasal dari tanah, plastic. Ini merupakan dari karakteristik dari suatu organism yang didapat dengan Eukaryota, Metazoa, Arthropoda, Hexapoda, Insecta, Pterygota, Neoptera, Endopterygota, Diptera, Nematocera, Culicoidea dan Culicidae.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Dari praktikum dasar – dasar bioteknologi kali ini dapat diambil beberapa kesimpulan yang diantaranya yaitu:
1) Isolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel; lisis dinding dan membran sel; ekstraksi dalam larutan; purifikasi; dan presipitasi. Diperoleh DNA kromosom dan plasmid dengan kemurniannya cukup tinggi dilihat dari hasil elektroforesis yang baik. Ketelitian dan kecermatan dalam pelaksanaan penelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan plasmid.
2) Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan.
3) Identifikasi DNA dilakukan untuk mengetahui tingkat hubungan kekerabatan dari suatu bakteri dengan bakteri yang lain atau juga bisa disebut dengan istilah dengan pohon filogenik
5.2. Saran
1) Mohon dijelaskan untuk lebih detail lagi tentang teknik – teknik isolasi DNA
2) Pada praktikum berlangsung dengan sangat menyenangkan, karna asistenya sangat ramah – ramah dan menjelaskan dengan sabar.
3) Kurangnya waktu untuk praktikum kali ini, karena banyak alat – alat dan teknik – teknik dari isolasi DNA yang belum diketahui oleh para praktikan.
Daftar Pustaka
Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM.Yogyakarta.
Ausabel. F.M, et al. 1992. Short Protocols in Moleculer Biology, Third ed. John Wiley & Sons.
Inc. USA.
Brown, A.T. 1991. Pengantar Kloning Gen (Alih bahasa: S.A. Muhammad dan Praseno).Yayasan Esensia Medika. Yogyakarta.
Kimbal, John W. 1989. Biologi. Edisi kelima cetakan kedua. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar - dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Lodish, Harvey, et al. 2001. Molecular Cell Biology, Fourth Edition. W.H. Freeman and Company. New York.
Murray. R.K, at al. 1995, Biokimia Harper, edisi ke-22. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.
Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta.
Sambrook, L., et al. Molecular Clonning : A laboratory Manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Schmid, R.D. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. Wiley- VCH. Germany.
Watson, James D. Tooze, John. Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar